通过体外转录（IVT）获得的mRNA反应混合物中，除了所需的mRNA产物外，还包含多种杂质，如T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、模板DNA、盐离子、添加剂以及IVT过程中产生的副产物（如dsRNA和截短RNA片段）。这些杂质可能对mRNA的功能产生不利影响，进而影响其定量准确性、翻译效率或免疫原性。因此，必须采用有效的纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离出来，以确保其纯度和完整性，从而保障mRNA疫苗和药物的安全性与有效性。

常见的mRNA纯化方法

目前，常用的mRNA纯化方法包括氯化锂沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化和层析纯化等。其中，沉淀法、磁珠法和硅胶柱膜法操作简单快速，但其适用性主要局限于科研和早期应用，纯化效率有限。在工业生产中，层析纯化则成为最主要的选择。

硫酸铵沉淀法

2024年1月，中科院过程工程研究所的研究团队在文章中探讨了硫酸铵沉淀mRNA的可行性。研究显示，当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。进一步提高硫酸铵浓度并未显著提升沉淀速率。此外，溶解率也是一个重要指标，室温下浓度超过18M时沉淀物可在3分钟内迅速溶解，溶解率超过90%。作者推荐最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS），pH 7.0，温度20℃，沉淀时间2小时，实现接近100%的沉淀率和溶出率。

比较硫酸铵与氯化锂沉淀法

硫酸铵和氯化锂法均对NTP的去除率高于99%，DNA模板的去除率分别为82.08%和85.88%。不过硫酸铵沉淀法在室温下操作，使工业化生产流程更为便利。

硅胶柱膜纯化法

硅胶柱膜纯化法主要依赖硅胶表面的硅醇基团与mRNA分子的相互作用。该方法不仅对mRNA的纯化效率高，而且对蛋白质、多糖等杂质几乎没有吸附作用，确保在高速离心过程中杂质被有效甩出。此外，硅胶柱膜材料安全无毒，符合环保标准，有利于保护实验人员的健康。

磁珠法与层析法

目前，工业级纯化多使用层析法以获取更高质量和产能的核酸。Oligo(dT)亲和色谱为主流mRNA纯化方法，但其不能区分带有Poly(A)尾的ssRNA和dsRNA杂质。因此，结合疏水层析、阴离子层析等技术，能够有效提高纯化的精细程度。

阴离子层析

利用目标mRNA与杂质之间的电荷差异实现纯化。这种方法在室温下也能有效分离DNA与ssRNA，相较于高温操作，简化了工艺流程。

蛋白酶K纯化

在IVT产物质量较高时，可以采用蛋白酶K与TFF工艺进行下游纯化。蛋白酶K作为高效的全能丝氨酸蛋白酶，能有效去除与核酸结合的蛋白质。但在应用中需优化添加量，以确保mRNA的完整性。此外，尊龙凯时也在开发用于检测蛋白酶K残留的试剂盒，以保障mRNA疫苗的安全和有效性。

尊龙凯时的mRNA纯化工艺服务

尊龙凯时通过自主开发的平台化mRNA纯化工艺，提供工业级mRNA原液定制化生产服务，针对不同类型的mRNA及需求涵盖全过程的工艺开发。经过工艺开发后，某客户的mRNA原液完整度提升了115%，总蛋白残留降低至0.02%。同时，尊龙凯时开发的mRNA纯化试剂盒，在科研和早期研究中因其便捷性和高效性得到了广泛应用。

总结与展望

尊龙凯时致力于为生物医药领域提供更全面的支持，包括高性能的酶原料、IVT试剂盒及质控试剂盒，构建从原料到成品的全方位解决方案。我们期待与您进一步合作，共同推进新药开发的进程。